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Annexin是一类广泛分布于真核细胞细胞浆内钙离子依赖的磷酯结合蛋白，参与细胞内的信号转导。Annexin V选择性结合磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine，简称PS)，磷酯酰丝氨酸主要分布在细胞膜内侧，即与细胞浆相邻的一侧。在细胞发生凋亡的早期，不同类型的细胞都会把磷酯酰丝氨酸外翻到细胞表面，即细胞膜外侧。磷酯酰丝氨酸暴露到细胞表面后会促进凝血和炎症反应。而Annexin V和外翻到细胞表面的磷酯酰丝氨酸结合后可以阻断磷酯酰丝氨酸的促凝血和促炎症反应活性。本试剂盒用带有绿色荧光的荧光探针iFluor 488标记的Annexin V，即Annexin V-iFluor 488，这种特性使得试剂盒能适合于FITC滤光器。本试剂盒和FITC一样可以用流式细胞仪或荧光显微镜非常简单而直接地检测到磷酯酰丝氨酸的外翻这一细胞凋亡的重要特征。本试剂盒提供所有必需组分及流式细胞仪检测是最佳方法。

组分	规格
组分A：Annexin V-iFluor 488(100X)	200μL
组分B：Assay Buffer	50mL
组分C：Propidium Iodide(100X)	100μL

保存：2～8℃，避光，避免反复冻融，有效期1年。


对于贴壁细胞，Annexin V流式细胞检测过程中，细胞消化，离心等过程要轻柔，尽量避免人为损伤的细胞，引起假阳性。

• 用药物处理细胞，诱导细胞凋亡（喜树碱4～6小时诱导Jurkat细胞凋亡）。
  
• 离心收集细胞，1～5×10⁵cells/管。
  
• 用200μL Assay Buffer (组分B)重悬细胞；
  
• 加入2μL Annexin V-iFluor 488（组分A）到上述细胞悬液中；
  选做：对于坏死细胞，需要加入2μL Propidium Iodide(100X，组分C)
  
• 室温，避光孵育30～60分钟；
  选做：在使用流式细胞仪检测之前可以加入200-300 Assay Buffer (组分B)重悬细胞，以增加细胞悬液的体积。
  
• 经过处理的细胞此时可以在流式细胞仪上分析，Annexin V-iFluor 488绿色荧光（FL1 channel）强度检测，Ex/Em= 490/525nm，细胞活性检测使用propidium iodide（组分C）（FL2 channel）。

对于未进行诱导凋亡的细胞，Annexin V-iFluor 488能检测出2～6%细胞是发生正常凋亡的。在发生凋亡的细胞中都会把磷酯酰丝氨酸外翻到细胞表面，而Annexin V-iFluor 488和外翻到细胞表面的磷酯酰丝氨酸结合，因而，提高染色检测的敏感性。

图1．检测Jurkat细胞中Annexin V-iFluor 488与磷酯酰丝氨酸结合能力。用喜树碱（终浓度为20μM）处理Jurkat细胞（红色），未处理的Jurkat细胞作为空白对照（蓝色）；37℃，5% CO₂培养箱孵育4～5小时；Annexin V-iFluor488染色30分钟。使用FACSCalibur (Becton Dickinson,San Jose,CA)流式细胞仪（FL1channe）检测Annexin V-iFluor488的荧光强度。
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